蛋白Marker是蛋白電泳實(shí)驗(yàn)的核心參照物，用于判定蛋白分子量、監(jiān)控電泳進(jìn)程、比對(duì)目標(biāo)條帶大小，其條帶完整性、清晰度直接決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。蛋白Marker多為預(yù)染或非預(yù)染的蛋白混合液，含有蛋白穩(wěn)定劑、緩沖液、染料等成分，保存不當(dāng)、反復(fù)凍融會(huì)直接導(dǎo)致蛋白降解、條帶彌散、缺失、模糊，甚至整支Marker報(bào)廢。遵循規(guī)范的保存流程，做好分裝管控，規(guī)避反復(fù)凍融，是保證Marker條帶清晰、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠的關(guān)鍵。
一、蛋白Marker標(biāo)準(zhǔn)保存規(guī)范
蛋白Marker的常規(guī)保存需嚴(yán)格遵循產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求，多數(shù)常規(guī)蛋白Marker需長(zhǎng)期置于-20℃低溫冷凍保存，部分高穩(wěn)定性Marker可短期2-8℃冷藏，嚴(yán)禁常溫放置。開(kāi)啟后的Marker務(wù)必密封嚴(yán)實(shí)，防止水分蒸發(fā)、蛋白濃縮變性，同時(shí)避免外界灰塵、細(xì)菌污染，防止蛋白變質(zhì)。
保存環(huán)境需保持恒溫，避免頻繁開(kāi)關(guān)冰箱門(mén)導(dǎo)致溫度波動(dòng)，取用完畢后立即放回冷凍層，減少常溫暴露時(shí)間。對(duì)于含甘油的蛋白Marker，甘油可起到防凍保護(hù)作用，即便在-20℃也不會(huì)凍結(jié)，無(wú)需反復(fù)凍融，可置于-20℃長(zhǎng)期存放；不含甘油的Marker凍存后會(huì)凝固，取用更要嚴(yán)控凍融次數(shù)。
二、反復(fù)凍融對(duì)條帶清晰度的核心影響
反復(fù)凍融是破壞蛋白Marker質(zhì)量、導(dǎo)致條帶失真的主要原因，每一次解凍再凍結(jié)，都會(huì)對(duì)蛋白造成不可逆損傷。凍融過(guò)程中，溶液內(nèi)形成的冰晶會(huì)刺破蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白條帶降解、斷裂，原本清晰的條帶出現(xiàn)彌散、拖尾、邊緣模糊，甚至出現(xiàn)雜帶、假帶，干擾分子量判定。
多次凍融會(huì)打破Marker內(nèi)部緩沖體系，導(dǎo)致各分子量條帶濃度不均，出現(xiàn)條帶深淺不一、部分條帶消失、條帶偏移等問(wèn)題，失去參照物價(jià)值。同時(shí)，凍融會(huì)加速染料降解，預(yù)染Marker會(huì)出現(xiàn)顏色變淺、條帶色差變小，電泳過(guò)程中難以肉眼分辨，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)觀測(cè)和結(jié)果判讀。通常經(jīng)過(guò)3-5次反復(fù)凍融，Marker條帶清晰度就會(huì)大幅下降，凍融次數(shù)越多，損壞越嚴(yán)重。
分裝是杜絕反復(fù)凍融的有效手段，提前將整支Marker分裝為單次用量，單次取用一管，避免整管反復(fù)開(kāi)蓋凍融，大幅延長(zhǎng)Marker使用壽命。分裝前提前將冷凍的Marker緩慢解凍至融化，輕柔顛倒混勻數(shù)次，嚴(yán)禁劇烈震蕩，防止蛋白變性。
根據(jù)日常實(shí)驗(yàn)用量，選擇10-50μL的無(wú)菌PCR管分裝，每管為單次電泳用量，避免分裝量過(guò)大造成剩余浪費(fèi)、過(guò)小導(dǎo)致取用不便。分裝過(guò)程需在低溫、無(wú)菌環(huán)境下操作，動(dòng)作迅速，減少常溫暴露時(shí)間，分裝好后立即密封管口，做好標(biāo)記，標(biāo)注名稱(chēng)、分裝日期、分子量，統(tǒng)一置于-20℃凍存。
四、分裝與保存額外注意事項(xiàng)
分裝所用離心管、槍頭必須無(wú)菌無(wú)酶，避免外源酶類(lèi)導(dǎo)致蛋白降解；分裝時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，防止蛋白氧化變性。嚴(yán)禁將分裝后的Marker反復(fù)凍融，已解凍未用完的試劑，不建議再次凍存，優(yōu)先單次用完。
取用Marker時(shí)，提前從冰箱取出所需分裝管，室溫快速解凍或手心溫?zé)峤鈨?，解凍后立即使用，不要長(zhǎng)時(shí)間放置。避免將Marker放置在冰箱門(mén)邊、出風(fēng)口等溫度波動(dòng)大的位置，選擇恒溫深處存放。定期檢查分裝Marker狀態(tài)，若出現(xiàn)渾濁、沉淀、顏色異常，說(shuō)明已變質(zhì)，禁止使用。
規(guī)范的低溫保存、科學(xué)的分裝操作，能規(guī)避反復(fù)凍融帶來(lái)的蛋白損傷，讓蛋白Marker始終保持條帶清晰、濃度均勻，保證電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)可靠，減少試劑浪費(fèi)，提升實(shí)驗(yàn)成功率。
